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Untersuchung und Bewertung der Karzinogenese

Karzinogenese

Die Karzinogenese wird mit verschiedenen standardisierten toxikologischen Tests untersucht. Ein erster Teil dieser Tests wird in vitro durchgeführt, und wenn sie positiv sind, wird ein in vivo-Experiment durchgeführt. Dieser schrittweise experimentelle Ansatz wird ENTSCHEIDUNGSPUNKT-ANSATZ genannt, eine Sequenz von Tests, die am Ende jedes Versuchs endet, um zu entscheiden, wie mit Experimenten verfahren wird. Es gibt fünf Stufen:

PHASE A: Struktur und Merkmale der krebserzeugenden Verbindung;

FASEB: In dieser Kurzzeit-Testphase in vitro werden Säugetierzellen verwendet. Die am häufigsten verwendeten Zellen sind Hepatozyten, weil wir das Ausmaß der Schadensreparatur untersuchen werden, die der Hepatozyt entsprechend der Schwere der durch die Substanz verursachten Schädigung entwickelt. Kurz gesagt, der Schaden an sich wird bestimmt, aber wie viel Reparatursystem wurde von der Leberzelle aktiviert.

Das implementierte Verfahren besteht darin, 3 Hepatozytenkulturen zu bilden. In der ersten Kultur sind die Hepatozyten gesund, in der zweiten werden sie mit der Testsubstanz behandelt und in der dritten werden sie mit einer definitiv karzinogenen Kontrollsubstanz behandelt. Diese drei Kulturen enthalten eine radioaktive Pyrimidinbase, bei der es sich um tritiiertes Thymidin handelt, das als Marker wirkt.

Wenn die zu testende Verbindung eine Mutation auf der DNA-Ebene verursacht, reagiert die Zelle auf dieses Problem, indem sie die Reparatursysteme aktiviert. Das DNA-Stück, das die Mutation durchgemacht hat, wird geschnitten und dank der Wirkung der DNA-Polymerase wird das fehlende Stück durch ein neues Stück ersetzt. Zur Korrektur nutzt DNA-Polymerase die neuen Basen, einschließlich tritiiertes Thymidin. Daher wird eine radioaktive Base in die Schneidzone eingebaut. Die Analyse der Radioaktivität stellt das Ausmaß der Mutation in den behandelten Zellen fest: je höher die Radioaktivität ist, desto größer sind die Mutationen in der DNA.

Auch in Phase B werden Tests an den Bakterien durchgeführt, um zu untersuchen, ob Retromutationen vorliegen. Die verwendeten Bakterien sind Salmonellen, die bereits Träger von Mutationen sind. Die Mutation beeinflusst die Synthese von Histidin, so dass Salmonellen nicht ohne Histidin wachsen können. Diese Bakterienkolonien werden teilweise mit der Testsubstanz behandelt, teils für die Negativkontrolle und teils für die Positivkontrolle, anschließend mit einem bekannten Karzinogen getestet. Ist diese Prüfsubstanz indirekt genotoxisch, müssen die metabolisierenden Enzyme in das Kulturmedium eingebracht werden. Zu diesem Zeitpunkt gibt es 3 Kulturen, die in Petrischalen ausgesät und kultiviert werden (es gibt kein Histidin im Kulturmedium). Wenn es keine Mutationen auf Seiten des zu testenden Karzinogens gab, sollte theoretisch kein Wachstum auf den Platten auftreten. Wenn das Karzinogen mutagen wirkt, könnte dies die erste Mutation verändert haben und eine zweite Mutation erzeugt haben, die das Wachstum der Bakterien auf dem Histidin-freien Kulturmedium ermöglicht. In diesem Fall wird die zweite Mutation, die die erste Mutation verändert, RETROMUTAZIONE genannt. Wenn schließlich die Piasta Petri signifikant wächst, ist das Karzinogen direkt.
Immer mit einem In-vitro-Test ist es möglich, die chromosomale Integrität zu bestimmen. Dieser Test wird immer an Säugetierzellen durchgeführt und wird verwendet, um toxische Substanzen zu testen, die Mutationen an einigen Enzymen verursachen können, die für die DNA-Biosynthese verantwortlich sind. Die zu testende Substanz wird einer In-vitro-Analyse unterzogen. Um zu bestimmen, ob die Testsubstanz auf die Integrität und die Anzahl der vorhandenen Chromosomen einwirken wird, wird der Mikronukleustest verwendet. Mikronuklei sind Vesikel, die einen Teil des Chromatins bilden. Das in diese Mikronuklei eingebaute Chromatin könnte entweder ganze Chromosomen oder Fragmente von Chromosomen sein. Die Mikronuklei werden aus der falschen Zellteilung gebildet, die Tochterzellen mit nicht gleichmäßig geteiltem genetischem Material entspringt. Das Ergebnis dieses Tests wird die Bestimmung von Substanzen sein, die als klastogene und Spindelgifte bezeichnet werden. Die klastogene Substanz produziert Mikronuklei mit azentrischen Chromosomenfragmenten, so dass die Substanz einen Bruch der Chromosomen induziert, stattdessen erzeugt die Giftsubstanz der Spindel Mikronuklei, in denen sich ganze Chromosomen befinden.
Wenn die Testsubstanz in einem oder mehreren Tests Genotoxizität induziert, spricht man von einer hohen Verdachtsdiagnose, dann geht es direkt in Phase D. Wenn die getestete Substanz keine genotoxische Wirkung zeigt, geht sie in die Studienphase C, da sie Promotor sein kann.

FASEC: In dieser Phase können sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Tests durchgeführt werden.

Für In-vitro-Tests konnten wir die Möglichkeit aufzeigen, dass die Promotor-Effekt-Substanz die Gap-Junction zwischen normalen Zellen und Tumorzellen aufbricht, mit dem konsequenten Durchgang von Substanzen zwischen den beiden Zellen.

Ein In-vivo-Test soll Hauttumoren bei der Maus induzieren. Die Testsubstanz wird zwei- bis dreimal in einer Woche auf die Haut der Maus aufgetragen. Innerhalb von 2/3 Monaten, wenn diese Substanz ein Promotor ist, kann es einige Formationen von Papillomen geben. Bei Mäusen werden zwei Hauptdaten berücksichtigt: die Anzahl von Mäusen, die von Papillomen betroffen sind, und die Anzahl von Papillomen, die bei jedem Tier vorhanden sind. Wenn die Substanz als Promotor wirkt und bei der behandelten Ratte einen Tumor entwickelt, bedeutet dies, dass es sich tatsächlich um eine promotorfördernde Substanz handelt.

Sobald diese Tests abgeschlossen sind, werden die Tests den Langzeit-In-vivo-Tests unterzogen.

FASED: In dieser Phase werden alle Verbindungen, die Mutagene beweisen, und alle Verbindungen, die keine Mutagene zeigen, getestet. Die Tests, die durchgeführt werden können, sind unterschiedlich, von denen einige Tests an der Leber, der Lunge und schließlich an der Brust sind.

Der Leber-Test zeigt die Bildung nicht eines neu gebildeten Tumors, sondern eines neoplastischen Fokus, dann etwas, das sich darauf vorbereitet, ein Tumor zu werden. Die Zellen dieses Fokus sind bereits atypische Zellen, daher haben sie eine Mutation erfahren und bereiten sich darauf vor, neoplastische Zellen zu werden.Nach einiger Zeit, dank der Autopsieuntersuchung, wird die Bildung des präneoplastischen Fokus bestimmt, wobei Anzahl und Ausmaß dieser prä-neoplastischen Formationen berechnet werden.

Der Lungentest ermöglicht die Bestimmung eines Adenoms, welches eine Anomalie der Lungengewebszellen darstellt. Auch in diesem Fall wird das Lungengewebe der Ratte nach einer längeren Zeit (Monate) gesehen (diese Adenome sind leicht identifizierbar, da sie weißliche Knoten auf dem Lungenepithel sind).
Der Brusttest ermöglicht die Bestimmung von Tumoren im Drüsengewebe. Es ist immer notwendig, die Anzahl der gebildeten Adenome und die Anzahl der Tiere mit Adenome zu bestimmen.

Wenn aus diesen Tests positive Ergebnisse hervorgehen, ist die Prüfsubstanz tatsächlich eine krebserregende Substanz. An diesem Punkt gehen wir zur Durchführung teurer Tests und mit sehr langen Ausführungszeiten über.

FASEE: In dieser Phase wird eine variable Anzahl von Tieren, von 20 bis 50, Langzeittests unterzogen.Diese Tests sind sehr teuer und benötigen eine lange Zeit, um bestimmte Ergebnisse zu erhalten; wir sprechen über ungefähr 1/8 des Lebens des Tieres. Es ist möglich, dass im Laufe dieser Tests einige Tiere sterben, aber sie werden immer mit einer Autopsie und einer histologischen Typuntersuchung untersucht. Die ausgewählten Tiere sind immer Ratten und Mäuse und nur 70-80% überleben bis zum Ende der Langzeittests. Die verwendeten Tiere werden nur entwöhnt, denn je jünger sie sind, desto empfindlicher sind sie für Behandlungen. Während der Langzeit-Testphase wird der Forscher immer von einem Mathematiker-Staatsmann begleitet, der in der Lage ist, alle gesammelten Informationen zu berücksichtigen und die verschiedenen Daten zu reproduzieren.

Die an Tieren getesteten Dosen beginnen mit der maximal tolerierten Dosis und all ihren Teilmengen, und die Dosis-Antwort-Reaktion im Tier wird bewertet.
Die Verabreichung muss sich immer dem Weg nähern, über den Menschen mit der Testsubstanz in Kontakt kommen können, dann dem oralen, kutanen oder respiratorischen Weg, während, wenn die Kanzerogenität eines Arzneimittels getestet wird, auch eine intravenöse Verabreichung nützlich ist.
Die getesteten Tiergruppen sind 4 (50 Tiere pro Gruppe):

  • Eine NAIF-Gruppe, die keine Behandlung hat;
  • Eine Gruppe, die mit dem Fahrzeug behandelt wurde;
  • Eine Gruppe, die mit der Testsubstanz behandelt wurde;
  • Eine Gruppe, die mit einem bekannten Karzinogen behandelt wurde.

Es ist sehr wichtig, dass die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe so gleich wie möglich ist. In der Tat, wenn es einen Unterschied in der Anzahl der Tiere gibt, kann der statistische Test gefälscht sein.
Die Auswertungen, die durchgeführt werden sollen, sind:

  • Gesamtzahl der Tumoren;
  • Häufigkeit einiger Tumore;
  • Häufigkeit von Tieren mit mehr als einer Tumorart;
  • Anzahl der Tumore für Tiere.

Am Ende all dieser Phasen des Studiums wird der Stoff in ein Ranking eingeordnet, das von der IARC (Internationale Agentur für Krebsforschung und -entwicklung) und der Environmental Protection Agency (EPA) aufgestellt wurde.